aatbio Covidyte™ TF670說明書

Covidyte™ TF670

概述

冠狀病毒 (CoV) 可以感染人類和多種動物，引起廣泛的疾病。2019 年底，一種被稱為嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒 2 (SARS-CoV-2) 的冠狀病毒被確定為導(dǎo)致幾例呼吸系統(tǒng)疾病 (Covid19) 的原因。該病毒在全球范圍內(nèi)迅速傳播。它已經(jīng)感染了超過 100 萬人，Covid19 已造成 7 萬多人死亡（截至 2020 年 4 月 6 日）。目前，沒有任何具體有效的治療 Covid19 的選擇。目前，Covid19的臨床治療主要是對癥聯(lián)合對已上市的抗病藥物如瑞德西韋和抗生素進(jìn)行再利用來治療繼發(fā)感染。Covidyte™ TF670 是一種包含 14 個氨基酸序列 (KTSAVLQSGFRKME) 的肽底物，可被冠狀病毒蛋白酶切割。dark-FRET 肽在 N 端和 C 端分別含有 Tide Quencher™ 5 (TQ5) 作為猝滅劑和 Tide Fluor™ 5 (TF5) 作為熒光供體，其中 TF5 的熒光在肽段被 TQ5 有效猝滅時完好無損。當(dāng)肽被冠狀病毒蛋白酶水解時，TF5 片段會產(chǎn)生顯著增強(qiáng)的熒光，因?yàn)樗臒晒獠辉俦?TQ5 淬滅。TF5的熒光強(qiáng)度可以有效監(jiān)測冠狀病毒蛋白酶的活性。Covidyte™ TF670 是一種強(qiáng)大的高通量篩選工具，用于搜索冠狀病毒蛋白酶的抑制劑。TQ5-TF5 對已被證明是用于開發(fā) FRET 蛋白酶底物的極為有效的 FRET 對。與常用的 EDANS 底物（如 Covidyte™ EN450）相比，TF670 底物具有更強(qiáng)和更長的熒光，較少受有色化合物的干擾，而這些有色化合物通常會導(dǎo)致假陽性命中。

示例協(xié)議

準(zhǔn)備解決方案

除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應(yīng)分成一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在 -20°C。避免重復(fù)凍融循環(huán)。

Covidyte™ TF670 原液 (200X)

將 25 µL（對于 cat# 13540）或 250 µL（對于 cat# 13541）DMSO 添加到 Covidyte™ TF670 小瓶中。
注意     制作一次性等分試樣并儲存在 -20 °C。

準(zhǔn)備工作解決方案

1. Covidyte™ TF670 工作液

在 20 mM Tris 緩沖液 (pH 7.5) 或您選擇的緩沖液中以 1:200 稀釋底物儲備溶液。在 96 孔板中每次測定使用 50 μL 的底物溶液。

2. 冠狀病毒蛋白酶稀釋

根據(jù)需要稀釋冠狀病毒蛋白酶。

示例實(shí)驗(yàn)協(xié)議

一個 96 孔板的樣品協(xié)議

1. 將 50 μL 的每種蛋白酶稀釋液添加到檢測板的各個孔中。
   

2. 在每個蛋白酶稀釋液中加入 50 μL Covidyte™ TF670 工作溶液。
   

3. 在 Ex/Em = 640/680 nm（截止 660 nm）處使用熒光讀板器監(jiān)測熒光增加。 

對于動力學(xué)讀數(shù)：立即開始連續(xù)測量熒光強(qiáng)度，每 5 分鐘記錄一次數(shù)據(jù)，持續(xù) 30-120 分鐘。
對于終點(diǎn)讀數(shù)：在所需溫度下孵育反應(yīng) 30 至 120 分鐘，避光。然后測量熒光強(qiáng)度。

示例數(shù)據(jù)分析和數(shù)據(jù)

圖 1.蛋白酶在蛋白質(zhì)激活、細(xì)胞調(diào)節(jié)和信號傳導(dǎo)以及生成用于蛋白質(zhì)合成或在其他代謝途徑中利用的氨基酸中發(fā)揮重要作用。FRET 蛋白酶底物廣泛用于檢測蛋白酶活性，特別是對于通常需要長肽序列以實(shí)現(xiàn)最佳結(jié)合的病毒蛋白酶，例如冠狀病毒、HIV 和 HCV 蛋白酶。內(nèi)部猝滅的 FRET 肽底物被蛋白酶消化以產(chǎn)生高熒光肽片段。熒光增加與蛋白酶活性成正比。Tide Quencher™ 染料與我們明亮的 Tide Fluor™ 和 iFluor™ 染料一起被證明是開發(fā) FRET 蛋白酶底物以用于高通量篩選應(yīng)用的極其有效的淬滅劑。

圖片

圖 1.蛋白酶在蛋白質(zhì)激活、細(xì)胞調(diào)節(jié)和信號傳導(dǎo)以及生成用于蛋白質(zhì)合成或在其他代謝途徑中利用的氨基酸中發(fā)揮重要作用。FRET 蛋白酶底物廣泛用于檢測蛋白酶活性，特別是對于通常需要長肽序列以實(shí)現(xiàn)最佳結(jié)合的病毒蛋白酶，例如冠狀病毒、HIV 和 HCV 蛋白酶。內(nèi)部猝滅的 FRET 肽底物被蛋白酶消化以產(chǎn)生高熒光肽片段。熒光增加與蛋白酶活性成正比。Tide Quencher™ 染料與我們明亮的 Tide Fluor™ 和 iFluor™ 染料一起被證明是開發(fā) FRET 蛋白酶底物以用于高通量篩選應(yīng)用的極其有效的淬滅劑。

圖 2. Covidyte™ TF670 的化學(xué)結(jié)構(gòu)。