上海起發(fā)為System Biosciences特約經(jīng)銷商，System Biosciences,簡稱SBI，美國加州灣區(qū)新成立的生技公司，致力于*、創(chuàng)新生物技術(shù)之開發(fā)，以研發(fā)利于基因及蛋白質(zhì)功能鑒定、研究之嶄新方法和工具為宗旨。 現(xiàn)階段研發(fā)重心為RNA干擾（RNAi）研究之相關(guān)工具。 System Biosciences (SBI) 致力于開發(fā)*、革新的技術(shù)，為客戶研究蛋白組學(xué)和基因組學(xué)功能提供研究工具。SBI 是專業(yè)的慢病毒產(chǎn)品公司，提供基于慢病毒的所有相關(guān)產(chǎn)品、質(zhì)粒、試劑盒及相關(guān)配套試劑和慢病毒延伸產(chǎn)品如IPS細(xì)胞多功能性誘導(dǎo)試劑盒和RNAi篩選文庫。

SBI CAS720A-KIT說明書

品牌：System Biosciences

貨號：CAS720A-KIT

品名：-T7-hspCas9-H1-gRNA All-in-one Cas9 SmartNucleaseTM Plasmid & Multiplex gRNA Cloning Kit

產(chǎn)品信息

增強(qiáng)您的一體化Cas9 SmartNuclease質(zhì)粒與多路復(fù)用gRNA傳遞

通過將CAG-T7-hspCas9-H1-gRNA一體化Cas9 SmartNuclease TM質(zhì)粒與Multiplex gRNA克隆試劑盒相結(jié)合，輕松提高功能?？傊@兩種產(chǎn)品可以實(shí)現(xiàn)更廣泛的需要多種gRNA的復(fù)雜基因組編輯項(xiàng)目。

您可以獲得CAG-T7-hspCas9-H1-gRNA All-in-one Cas9 SmartNuclease質(zhì)粒的所有優(yōu)點(diǎn)：

• 方便地提供Cas9和gRNA與一個單一的載體
• 用CAG啟動子驅(qū)動Cas9表達(dá)，其在原代細(xì)胞和干細(xì)胞中提供高表達(dá)水平
• 從H1啟動子表達(dá)gRNA以獲得較大特異性并選擇靶標(biāo)
• 確保有效利用N期和C期核定位信號（NLS）將Cas9導(dǎo)入細(xì)胞核
• 在C-term NLS之后通過WPRE調(diào)控元件促進(jìn)Cas9基因表達(dá)并穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄本
• 用N-term myc-tag輕松檢測和/或純化Cas9蛋白
• 使用T7啟動子通過體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生Cas9 mRNA

結(jié)合Multiplex gRNA克隆試劑盒的優(yōu)點(diǎn)：

• 一次編輯多個基因座，節(jié)省時間和試劑
• 容易產(chǎn)生多順反子gRNA表達(dá)構(gòu)建體
• 適用于Cas9切割酶應(yīng)用
• 非常適合研究信號通路

正如我們所有的Cas9交付選項(xiàng)一樣，CAG-T7-hspCas9-H1-gRNA質(zhì)粒在功能上得到了驗(yàn)證，并得到了我們的專家團(tuán)隊(duì)的支持 - 如果您有基因組工程問題，只需通過電子郵件tech @ systembio發(fā)送問。 com。

為什么建議使用人力資源定位向量

盡管單獨(dú)由Cas9引起的DSB可導(dǎo)致基因敲除，但SBI建議使用HR靶向載體（也稱為HR供體載體）以實(shí)現(xiàn)更有效和的突變。人力資源捐助者可以提供正面或負(fù)面選擇的要素，以確保更容易識別成功的突變事件。此外，HR供體可以包含高達(dá)6-8 kb的開放閱讀框用于基因敲入或標(biāo)記，并且當(dāng)5'或3'同源臂中包含小突變時，可以進(jìn)行特定的靶向基因編輯。

使用此表格選擇適合您的CRISPR / Cas9產(chǎn)品：

使用SBI的一體化Cas9 SmartNuclease質(zhì)粒和Mulitplex gRNA克隆試劑盒

工作流程一目了然  

圖1. Multiplex gRNA克隆試劑盒工作流程。

使用Multiplex gRNA克隆試劑盒準(zhǔn)備您的多重gRNA插入片段（圖1）

PrecisionX Multiplex gRNA克隆試劑盒提供H1和U6啟動子區(qū)域，可輕松構(gòu)建多個gRNA盒（圖1）。在步驟1中，將含有所需gRNA（由用戶設(shè)計(jì)）和腳手架 - 啟動子區(qū)段（來自試劑盒）的重疊末端的引物在PCR反應(yīng)中合并以產(chǎn)生含有兩種gRNA的PCR擴(kuò)增子。在步驟2中，將PCR擴(kuò)增子與融合反應(yīng)混合物一起與用于無縫構(gòu)建的線性化表達(dá)載體組合。

• 轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中并在LB /卡那霉素平板（50μg/ ml）中生長
• 通過直接測序確認(rèn)陽性克隆
• 使用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染方案將經(jīng)過序列驗(yàn)證的一體化構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到哺乳動物細(xì)胞中（如果您的應(yīng)用需要，與HR靶向載體共轉(zhuǎn)染）
• 進(jìn)行Surveyor核酸酶測定（或其他適合的錯配切割測定）以檢查位點(diǎn)特異性基因組切割并選擇期望的克隆

用CRISPR / Cas9進(jìn)行基因組工程

有關(guān)使用CRISPR / Cas9技術(shù)進(jìn)行基因組工程的一般指導(dǎo)，請查看我們的CRISPR / Cas9教程以及以下應(yīng)用筆記：

CRISPR / Cas9基因敲除應(yīng)用簡報(bào)（PDF）» 
CRISPR / Cas9基因編輯應(yīng)用簡報(bào)（PDF）» 
CRISPR / Cas9基因標(biāo)簽應(yīng)用簡報(bào)（PDF）»

CRISPR / Cas9基礎(chǔ)

通過仔細(xì)選擇靶序列和設(shè)計(jì)供體質(zhì)粒進(jìn)行同源
重組，您可以使用CRISPR / Cas9實(shí)現(xiàn)且高度靶向的基因組修飾。

系統(tǒng)

Cas9蛋白質(zhì) - 指導(dǎo)RNA（gRNA）指導(dǎo)位點(diǎn)特異性雙鏈DNA切割，與目標(biāo)DNA中的原型銜接子基序（PAM）相鄰。

引導(dǎo)Cas9切割靶基因組中的同源區(qū)域的gRNA- RNA序列。僅當(dāng)gRNA同源性與PAM相鄰時才有效切割。

PAM- prototospacer銜接子基序NGG是目標(biāo)DNA序列，如果指向gRNA，spCas9將從上游切除。

工作流程一目了然

設(shè)計(jì)：選擇gRNA和HR供體質(zhì)粒。選擇gRNA位點(diǎn)并設(shè)計(jì)供
體質(zhì)粒決定同源重組事件是否導(dǎo)致敲除，
敲入，編輯或標(biāo)記。

構(gòu)建：將gRNA克隆到一體化Cas9載體中。將5'和3'同源臂克隆到HR 
供體質(zhì)粒中。如果創(chuàng)建基因敲入，將所需基因克隆到HR供體中。

共轉(zhuǎn)染或CO-INJECT：介紹Cas9，gRNA和HR捐贈者進(jìn)入靶細(xì)胞
使用共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)導(dǎo)為慢病毒，或共注射的mRNA。

選擇/屏幕：選擇或篩選突變體并驗(yàn)證。

VALIDATE：基因型或序列推定的突變體，以驗(yàn)證單個或雙等位基因轉(zhuǎn)化。

在多個基因組位置同時進(jìn)行編輯

請注意，本研究使用略有不同的All-in-One Cas9 SmartNuclease質(zhì)粒設(shè)計(jì)，但預(yù)期結(jié)果相似。

圖2. Multiplex gRNA克隆試劑盒可以有效地提供四種gRNA。 （A）我們使用了使用Multilplex gRNA克隆試劑盒和All-in-one Cas9 SmartNickase載體創(chuàng)建的四重gRNA，以從具有穩(wěn)定整合的CMV的細(xì)胞系中去除（B） 1260bp的GFP-T2A-RFP區(qū)段-GFP-T2A-RFP表達(dá)盒。我們將這四種gRNA克隆到Cas9 SmartNickase載體（EF1Nickase-H1-gRNA）中以指導(dǎo)兩個雙切口事件 - 一個在GFP的5'末端，另一個在RFP基因的3'末端。（C）使用僅在GFP和RFP基因外部的引物進(jìn)行的PCR測定在不存在SmartNickase載體（泳道1）的情況下產(chǎn)生1600bp片段，并且在存在Cas9SmartNickase-4gRNA構(gòu)建體（泳道2）的情況下產(chǎn)生340bp片段，證明SmartNickase介導(dǎo)的配對雙切口和GFP-T2A-RFP基因組缺失的效率。（D） GFP和RFP活性的缺失也可以在功能測定中看到，通過降低GFP和RFP熒光。

上海起發(fā)實(shí)驗(yàn)試劑有限公司是專業(yè)從事生物技術(shù)產(chǎn)品銷售的高科技企業(yè)，是國內(nèi)生物試劑、儀器、消耗品領(lǐng)域的企業(yè)之一。起發(fā)公司自成立以來，連續(xù)2年高速成長。公司的發(fā)展目標(biāo)是建成專業(yè)從事生物技術(shù)產(chǎn)品銷售、生產(chǎn)與開發(fā)的公司。 

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